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酶免疫技能對ELISA試劑盒試驗的優(yōu)勢
發(fā)布時間： 2018-01-11 點擊次數(shù)： 1557次ELISA試劑盒酶免疫技能是運用酶催化底物反響的生物擴(kuò)大作用，進(jìn)步特異性抗原-抗體免疫學(xué)反響檢測敏感性的一種符號免疫技能。該技能所用的酶要求純度高、催化反響的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)安穩(wěn)、來源豐厚、價格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)安穩(wěn)，繼續(xù)保存著它的活性部分和催化才能。在受檢標(biāo)本中不存在與符號酶相同的酶。別的它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)品易于測定，光吸收高。
一、酶和酶作用的底物
1.辣根過氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化辦法也不雜亂。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在275nm波利益有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，
在403nm波利益有zui高吸收峰。HRP對受氫體的專一性很高，除H202外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H202便利。
許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS.OPD為在ELISA中運用zui多的底物，靈敏度高，比色便利。其缺陷是配成運用液后安穩(wěn)性差，并且具有致異變性。TMB無此缺陷。TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍(lán)色，目測比照明顯；加酸中止酶反響后變，可在比色計中定量；因而運用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。
2.堿性磷酸酶（AP）：ELISA試劑盒是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的zui適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為l00kD，zui適pH為9.6.一般選用對**苯***（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，運用便利。ELISA試劑盒產(chǎn)品為的對**酚，在405nm有吸收峰。用NaOH停止酶反響后，可安穩(wěn)一段時間。
在ELISA中運用AP體系，其敏感性一般高于運用HRP體系，空白值也較低。但因為AP較難得到高純度制劑，安穩(wěn)性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結(jié)合物時得率較HRP低一級原因，國內(nèi)涵ELISA中一般均選用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經(jīng)酶水解后發(fā)作熒光物質(zhì)4-甲基傘酮，可用熒光計檢測。熒光的擴(kuò)大作用大大進(jìn)步了辦法的敏感度。AP也可運用可發(fā)作熒光的傘基***作底物。其缺陷是需求熒光計測定，并且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不行宣布熒光。脲酶的特色是酶作用后反響液發(fā)作pH改動，可使指示劑變色；別的，在人體內(nèi)沒有內(nèi)源酶。
二、ELISA試劑盒酶符號抗體或抗原
酶符號的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）?？乖驗榛瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的辦法與酶結(jié)合，如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參閱抗體酶符號的辦法。制備抗體酶結(jié)合物的辦法一般有以下幾種。
1.戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功用團(tuán)試劑，能夠使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如銜接AP），也可用二步法（如銜接HRP）。戊二醛一步法操作簡潔、有用，并且重復(fù)性好。缺陷是交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)厲，巨細(xì)也不一，影響作用。制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除掉戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而構(gòu)成酶標(biāo)抗體。此法的功率可高于一步法l0倍左右。
2.過碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子外表的多糖氧化為醛基。用***鈉（NaBH4）中和剩余的過碘酸。酶上的醛根很生動，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，構(gòu)成爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人以為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)zui有用的辦法。但也有只以為因為所用試劑較為劇烈，各批試驗成果不易重復(fù)。
按以上辦法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中zui終的酶活性測定，因通過洗刷，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競賽相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因而制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的辦法較多，別離大分子混合物的辦法均可運用。硫酸銨鹽析法操作簡潔，但作用不如用sephadexg-200凝膠過濾的好。
3.符號抗體判定：ELISA試劑盒一般選用棋盤滴定法進(jìn)行篩選，見第十九章。
三、ELISA試劑盒固相載體
酶免疫技能的首要試劑為固相的抗原或抗體、酶符號的抗原或抗體和與符號酶直接相關(guān)的酶反響底物。可作固相載體的物質(zhì)許多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的功能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保存本來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種方式，在測定進(jìn)程中，它作為載體和容器，不參加化學(xué)反響，加之它的價格低廉，所以被遍及選用。
聚苯乙烯載體的形狀首要有三種：小試管、小珠和微量反響板。小試管的特色是還能兼作反響的容器，zui終放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，外表經(jīng)磨砂處理后吸附面積大添加。如用特別的洗刷器，在洗刷進(jìn)程中使圓珠滾動淋洗，作用更好。zui常用的載體為微量反響板，于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，用的規(guī)范板形是8×12的96孔式。為便于作少數(shù)標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)或l2聯(lián)孔條的，放入座架后，巨細(xì)與規(guī)范ELISA板相同。ELISA板的特色是能夠一起進(jìn)行很多標(biāo)本的檢測，并可在特定的比色計上敏捷讀出成果?，F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反響板型的ELISA檢測，包含加樣、洗刷、保溫、比色等進(jìn)程，對操作的規(guī)范化極為有利。
杰出的ELISA板應(yīng)該是吸附功能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間功能相近。聚苯乙烯ELISA板因為配料的不同和制造工藝的不同，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因而每一批號的聚苯乙烯制品在運用前須查看其功能。常用的查看辦法為：以必定濃度的人IgG（一般為10ng／ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)參加恰當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗刷，加底物顯色，停止酶反響后別離測每孔溶液的吸光度。操控反響條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計算一切讀數(shù)的均勻值。一切單個讀數(shù)與均勻讀數(shù)之差應(yīng)小于10%.與聚苯乙烯相似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特色為質(zhì)軟板薄，可切開，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附功能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的好壞，可用以下辦法加以查驗：用其他免疫學(xué)測定辦法選出一個典型的陽性標(biāo)本和一個典型的陰性標(biāo)本。將它們別離進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)訂的ELISA操作進(jìn)程進(jìn)行測定，然后比較測定成果。在哪一種載體上陽性成果與陰性成果判別zui大，這種載體就是這一ELISA測定的zui合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種資料：一是微孔濾膜，如**纖維素膜、尼龍膜等，這類測定方式將在本章“膜載體的酶免疫測定"中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制造的，反響時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反響的速率，反響完畢后用磁鐵招引作為別離的手法，洗刷也非常便利，但需配備特別的儀器。
四、免疫吸附劑
ELISA試劑盒固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。ELISA試劑盒將抗原或抗體固相化的進(jìn)程稱為包被。因為載體的不同，包被的辦法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，一般將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA試劑盒ELISA板孔中在4℃夜，經(jīng)清洗后即可運用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體外表有能被此蛋白質(zhì)*掩蓋，ELISA試劑盒其后參加的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體外表，zui終發(fā)作非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，能夠消除這種干擾。這一進(jìn)程稱為關(guān)閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失掉其免疫活性。