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ELISA試劑盒顯色和比色分析
發(fā)布時(shí)間： 2017-10-23 點(diǎn)擊次數(shù)： 1643次在ELISA試劑盒試驗(yàn)中各種酶標(biāo)儀功能都會(huì)有所不同，所以在運(yùn)用中應(yīng)具體閱讀說明書，再進(jìn)行下一步操作。
自從20世紀(jì)60-70年代面世以來，Elisa法得到*科研工作者的認(rèn)可及推重，在歐美及我國(guó)取得很大的推行，尤其是國(guó)內(nèi)生化范疇的長(zhǎng)足發(fā)展。ELISA試劑盒有著準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等許多的長(zhǎng)處，它在檢測(cè)抗體、抗原等方面有很好的運(yùn)用，深受廣闊用戶朋友的喜愛。但是，在試驗(yàn)過程中，也需求留意許多問題，特別是顯色、比色問題。
顯色
ELISA試劑盒顯色是ELISA中的終究一步溫育反響，此刻酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)品。反響的溫度和時(shí)刻仍是影響顯色的要素。在一定時(shí)刻內(nèi)，陰性孔可堅(jiān)持無色，而陽性孔則隨時(shí)刻的延伸而呈色加強(qiáng)。恰當(dāng)提高溫度有助于加快顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中，參加底物后的反響溫度和時(shí)刻應(yīng)按規(guī)則力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)刻一般不需求嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色恰當(dāng)縮短或延伸反響時(shí)刻，及時(shí)判別。
OPD（鄰苯二胺）底物顯色一般在室外溫或37℃反響20-30分鐘后即不再加深，再延伸反響時(shí)刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反響應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反響結(jié)束時(shí)參加停止液停止反響。OPD產(chǎn)品用硫酸停止后，顯色由橙轉(zhuǎn)向棕。
TMB（四甲基聯(lián)苯胺）受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反響觀察成果。但為確保試驗(yàn)成果的安穩(wěn)性，宜在規(guī)則的恰當(dāng)時(shí)刻閱讀成果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)高峰，隨即逐漸削弱，至2小時(shí)后即可*消退至無色。TMB的停止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)刻（12-24小時(shí)）不褪，是目視判別的杰出停止劑。此外，進(jìn)口elisa試劑盒各類酸性停止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成，此刻可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。
比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于規(guī)范96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊際剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。
比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反響僅加底物液的孔）和空白孔，以記載本次試驗(yàn)的試劑情況。這以后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行核算。
比色成果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)則用吸光度（absorbence，A），兩者意義相同。一般的表明辦法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表明辦法為“A492nm”或“OD492nm”。
酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，一般指于測(cè)讀ELISA成果吸光度的光度計(jì)。針對(duì)固相載體方式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要功能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度和可測(cè)規(guī)模、線性等等。的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可準(zhǔn)確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說，若某孔測(cè)得的A值為1.083，則該孔相對(duì)于空氣的實(shí)在A值應(yīng)為1.083± 0.01(1.073～1.093)，重復(fù)測(cè)定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.078～1.088）在之間。酶標(biāo)儀的可測(cè)規(guī)模視各酶標(biāo)儀的功能而不同。一般的酶標(biāo)儀在0.000～2.000，新型號(hào)的酶標(biāo)儀上限拓展達(dá)2.900，乃至更高。超出可測(cè)上限的A值常以“*”或“over”或其它符號(hào)表明。應(yīng)留意可測(cè)規(guī)模與線性規(guī)模的不同，線性規(guī)模常小于可測(cè)規(guī)模，比方某一酶標(biāo)儀的可測(cè)規(guī)模為0.000～2.900，而其線性規(guī)模僅0.000～2.000，這在定量ELISA中制造規(guī)范曲線時(shí)應(yīng)予留意。
酶標(biāo)儀不該安頓在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15-30℃，運(yùn)用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀成果更安穩(wěn)。
ELISA試劑盒測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)品的靈敏吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次，*次在zui適波長(zhǎng)（W1），第2次在不靈敏波長(zhǎng)（W2），兩次測(cè)定間不移動(dòng)ELISA板的方位。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，終究測(cè)得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可削減由容器上的劃痕或指印等造成的光攪擾。