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    人血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)ELISA試劑盒

    發(fā)布時(shí)間: 2010-12-07  點(diǎn)擊次數(shù): 1553次

    預(yù)期應(yīng)用
    ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中PFKP含量。
     
    實(shí)驗(yàn)原理
    用純化的PFKP抗體包被微孔板,制成固相載體,往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的PFKP抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的PFKP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度( 值),計(jì)算樣品濃度。
     
    試劑盒組成及試劑配制
    1、 酶標(biāo)板:一塊(96孔)
    2、 標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品): 2瓶,請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,其濃度為100 U/L,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋),分別配制成100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,1.56 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制50 U/L標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml (不要少于0.5ml )100 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
    3、 樣品稀釋液:1×20ml。
    4、 檢測稀釋液A:1×10ml。
    5、 檢測稀釋液B:1×10ml。
    6、 檢測溶液A:1×120 /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋(如:10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A),充分混勻,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(100 /孔),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制  0.1-0.2ml。
    7、 檢測溶液B:1×120 /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
    8、 底物溶液:1×10ml/瓶。
    9、 濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
    10、終止液:1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)。
    11、覆膜:5張
    12、使用說明書:1份
     
     
     
     
    自備物品
    1、 酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)
    2、 微量加液器及吸頭,EP管
    3、 蒸餾水或去離子水,濾紙
     
    標(biāo)本的采集及保存
    1、 血清:全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    2、 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    3、 其它生物標(biāo)本:請1000 g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保    存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
     
    注:以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存,4 保存應(yīng)小于1周,-20 不應(yīng)超過1個(gè)月,-80 不應(yīng)超過2個(gè)月;標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
     
    操作步驟
    實(shí)驗(yàn)開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫,試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時(shí),均需充分混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量,如樣品濃度過高時(shí),應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
    1、 加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 ,注意不要有氣泡,加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37 溫育2小時(shí)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效
    性,每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
    2、 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 (臨用前配制),酶標(biāo)板加上覆膜,37 溫育1小時(shí)。
    3、 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400 /每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
    4、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100 ,加上覆膜,37 溫育1小時(shí)。
    5、 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,方法同步驟3。
    6、 每孔加底物溶液90 ,酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色(反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,后3-4孔梯度不明顯時(shí),即可終止)。
    7、 每孔加終止溶液50 ,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物    液的加入順序相同。
    8、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度( 值)。
     
    注:
    1、 試劑準(zhǔn)備:所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。
    2、 加樣:加樣或加試劑時(shí),*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
    3、 溫育:為防止樣品蒸發(fā),實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。
    4、 洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
    5、 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A時(shí),一次不要小于10 ),以避免由于不準(zhǔn)確稀  釋而造成濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
    6、 反應(yīng)時(shí)間的控制:加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
    7、 底物:底物請避光保存,在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
        
    洗板方法
    1、 手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
    2、 自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
     
    特異性
        本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人PFKP,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
     
    計(jì)算
      各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖(七點(diǎn)圖),如設(shè)置復(fù)孔,則 應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)), 值為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,如 curve expert 1.3,根據(jù)樣品 值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的 值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
     
    檢測范圍:1.56 U/L - 100 U/L,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請取用以下濃度值:100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,1.56 U/L。
     
    zui低檢測限:1 U/L
     
    說明
    1、  由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析,
        本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
    2、  zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),請務(wù)必
    準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
    3、 在儲(chǔ)存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的   污染,因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
    4、 試劑盒保存:請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ,其余試劑短期保存請置于4 ,長期保存則置于-20 。開封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于-20 ,避免潮濕。
    5、 濃洗滌液會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
    6、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì),此為正常現(xiàn)象,不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
    7、 有效期:6個(gè)月。
     
     

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